最有效的消解（jiě）植物中痕量硒方（fāng）法——智能石墨消解儀

硒(Seleniun,Se)是生命活動中必需的（de）微量元素,在人體（tǐ）中以硒蛋白的形式存在（zài）,具有提高免疫、抗氧化（huà）、抗腫瘤、延緩衰老、解毒（dú）和抗輻射等生物與生理功能。人體硒缺（quē）乏會降低硒（xī）蛋白的表達及生物學功能的正常發揮,會引起（qǐ）如貧血、冠心病、高血壓、癌症等40多種疾病,適（shì）量補硒有（yǒu）利於人體健（jiàn）康[1-3]。但（dàn）硒對人體的（de）有（yǒu）益生理功能必需控製在（zài）安全濃（nóng）度範圍之內,補硒過量又會引起生物體中毒[4],世界衛生（shēng）組織(WHO)、聯（lián）合國糧農組織(FAO)、國際原子能機構(IAEA)均（jun1）規定了明確指標:膳食硒的供給量為50~250μg•d-t,成人個（gè）體硒最高（gāo）安全攝（shè）入量為400g•d-1[5]。人體（tǐ）從環境中（zhōng）攝取硒的主要途徑是食物,食（shí）物鏈中（zhōng）硒又主要來源於植物,因此對植（zhí）物硒的準（zhǔn）確測定顯得十分重要。

1、實驗部分

1.1方法

目前測定硒的方法主要有光學分析（xī）法（fǎ）(分光光度（dù）法、熒光法、原（yuán）子熒光光（guāng）譜法（fǎ）,原子吸收（shōu）法等)6[6-8]、電化學分析法（fǎ）(陰（yīn）極溶出伏安法、極譜法等)[9,10]、色譜（pǔ）學分析法(離子色譜法、高效液相色譜法、氣相色譜法等)[11]、聯用技術(電感耦（ǒu）合（hé）等離子體質譜法)等[12,13],每種方（fāng）法都有其優缺點,在不（bú）同的情況下可選擇適當的檢（jiǎn）測方法進行分析。其中（zhōng）氫化物發生-原子（zǐ）熒光光譜法(HG-AFS)因其測定硒具有較高的靈敏度和精確度（dù）,所用試劑毒性小,操作簡便,實用性強,已入（rù）選食品安全國家標（biāo）準（zhǔn）“食品中硒的測（cè）定(GB5009.93-2010)”的第一（yī）法[14]，尤其適合痕量硒的測定，本工作采（cǎi）用氫（qīng）化物發生-原子熒光光譜法測定植物樣（yàng）品中的（de）硒。

植物硒多以有機形態存在，儀器測定前需轉化為無機離子，目前處理植物樣品（pǐn）的方法（fǎ）有幹灰法和濕法消解等方法，鑒於（yú）硒（xī）的易揮發（fā）特性，植物硒多采用濕法消（xiāo）解（jiě）。“國標法（fǎ）-食品中硒的測定(GB 5009.93-2010)”采用兩種濕消解法:硝酸十高氯酸“電熱板”敞開體係常壓消解法,硝酸十雙氧水“微波”密閉體係消解法。“電熱（rè）板”消解為傳統濕消解（jiě）法,簡便成本低,易操作,但試劑消（xiāo）耗多,溫度不能精確控製,消解時多憑經驗,消解溫度過高或時間過長極易造成硒損失,溫度過低有機硒又不能完全（quán）被消解,導致測定結果偏低。微波消解是目前被廣為推薦的一種微量元素消解方法,程序控溫,氧化劑用量少,微波消解（jiě）時間短且完全,但缺點是微波消解後還需在電熱板上趕（gǎn）走（zǒu）殘（cán）留餘酸才能確保測量的準確性。硒（xī）的易揮發性決定了（le）硒必須低溫趕酸,這一步驟所需時間較長,總體消化過程中隻是（shì）節省了微波（bō）消解（jiě）部分的時間,且單個樣品消（xiāo）化量較少,通常隻有0.1~0.5g。本法采（cǎi）用程序控溫的石墨消解儀消解處理植物硒,單個樣品消化量可達10.0g以（yǐ）上（shàng）,可以滿足痕（hén）量（liàng）樣品的大（dà）稱（chēng）樣量的分析要求。石墨消解（jiě）雖（suī）屬於敞開體係,但具有微波（bō）消解儀相同（tóng）的自動控溫（wēn）程（chéng）序,裝有試樣的消解管全部包裹於石墨加熱孔（kǒng）中,能量不易散失,加熱效率高（gāo）且（qiě）均勻,消解趕酸能同時進行。且石墨消（xiāo）解管還自帶刻度,消解完成後無需轉移樣液可直接定容,有別於電熱板和微波消解的（de）二次轉移重新定容過程,避免（miǎn）了在轉移過程中（zhōng）的汙染和（hé）損失。特別是儀器價格比微波消解儀低,經濟適用,常規實驗室都有能力購買,操作簡便安全,所用試（shì）劑毒性小（xiǎo）,一次（cì）可處理大批樣品,尤其適合植物樣（yàng）品批量分析,其測定結果令（lìng）人滿意。

1.2儀器與試劑

DS-360智能石墨（mò）消解儀;雙（shuāng）道（dào）原子熒光光（guāng）譜儀,高性能硒空心陰極燈(北京有色金屬研究（jiū）總院);超純水機,氬（yà）氣:純度為99,99%。

硝酸(HNO3)、高氯酸(HClO)、鹽酸(HCl)均為GR。硼氫化鉀溶液(10.0g•L-1):稱（chēng）取5.0g氫氧化鉀(KOHAR)溶於（yú）約（yuē）500mL純水（shuǐ）中,加入10.0g硼氫化鉀(KBH4CP),緩緩搖動使其溶解,定容至1000mL,混勻即可,現配現用。鐵（tiě）氰化鉀(100g•L-1)溶液:稱取10.0g鐵氰化鉀(K3Fe(CN)6),AR,溶於100mL純水（shuǐ）中,混勻。植物標樣為灌木葉(GBW07602/GSV-1)、柑橘葉(GBW10020/GSB-11)、茶葉(GBW10016/GSB7)、圓白菜(GBW10014/GSB-5),大米(GBW10010/GSB-1)分別購自地球（qiú）物理地球化學勘査硏（yán）究所。

硒標準儲備（bèi）液溶液(100mg•L-1),硒質控環境標準溶液(GSBZ50031-94(203710)),購自中（zhōng）國（guó）環境保護部標（biāo）準樣品（pǐn）研究所。試（shì）驗中純水為18.3MΩ•cm(25C)超純水。

1.3樣品（pǐn）與測試液的製備

稱取2.0g(精確至0.0001g)洗（xǐ）淨60C烘幹粉碎的植物樣,加入10.0mL硝酸十（shí）高（gāo）氯酸(8+2)(g)混（hún）酸及幾粒玻璃珠於100mL刻度消解管中,上端放彎頸（jǐng）玻璃小漏鬥便於回（huí）流,混勻放置在（zài）石（shí）墨消解儀的石墨加熱孔中,於通風良好的通風櫥內冷（lěng）消化過夜12h後（hòu）,石墨消解儀會按預先設（shè）定（dìng）的（de）消解程序進行升溫消化,升溫程序為:室（shì）溫→50C保持0.5h100C保持1h-→160C保持2h→-180C保持,最後保持時間視樣品消化情況而定。其間要觀察消化液顏（yán）色,若較深,及時（shí）補加硝酸,反複多次,直到沒（méi）有棕色氮氧化（huà）物氣體冒出。當溶液變為清亮無（wú）色並伴有濃白煙岀現時,繼續保持180C加熱,其間可加入1~2mL純水1~2次,目的（de）是趕殘（cán）餘酸,這樣可以解決濕法（fǎ）消（xiāo）解測定空白高的（de）特點,直至加熱消化到（dào）剩餘體積為2mL左右時,切不可蒸幹,取下冷（lěng）卻至室溫,再加入（rù）5.0mL50%HCl(g)於剩餘（yú）消化液（yè）中,再次至於消解儀中升溫（wēn）至100C(或沸水浴加熱),保持10~15mn,溶液變為清亮無色並伴有白煙（yān）時,逐（zhú）將（jiāng）Se+還原成Se+。取出冷（lěng）卻用純水定容至25mL,密封搖勻備（bèi）用。同（tóng）時做試劑空白。

測試液（yè）的製備:按所需（xū）稀釋比（bǐ）例吸取（qǔ）以上待（dài）測液的上清（qīng）液（yè）1.0~5,0mL至10mL比色（sè）管中（zhōng）,加入適量的（de）50%HCl(g)(以確保定容（róng）後的樣液酸度為15%),1.0mL鐵氰化鉀(10gg•L-1)溶液,純水定容並混勻。靜置30min後上機測試

1.4硒標準溶液配製

將100mg•L-1硒標（biāo）準儲備液用5%HCl溶液（yè）稀釋至100gg•L標準應用液。從100gg•L硒標準應用液中,分別移（yí）取0.00,0.50,1.00,2.00,3.00,4.00,5.00mL至7個50mL容量瓶中,加入少量純水,再分別（bié）向每個容量瓶中加入50%HCl15.0mL(以確保定容後的樣液酸度為15%),5.0mL鐵氰化鉀(100g•L-1)溶液,純水定容,即可得（dé）到一組濃度為0.00,1.00,2.00,4.00,6.00,8.00,10.00gg•L-1係列硒標準工作溶液

2、結果與討論

2.1原子熒光光譜儀工作（zuò）參數

考慮燈電（diàn）流、光電倍增管負高壓、載氣流量和（hé）反應介質等對分析靈（líng）敏度、精確度（dù）和準確度的影響,結合AFS-9700型雙道原子熒光光譜儀的儀器條件,經反複試驗,確定了植物（wù）硒測定的最（zuì）佳工作參（cān）數,特別對讀數時間和延遲時間進行了反複摸索,最終確定（dìng）了讀數時間為14s,延遲時間必須為6s時,在儀器的信號采集單元內才能獲得一個完整正態峰型,此時峰麵積最大（dà）,達到了最佳積分效果,說明在上述（shù）儀器工作條件（jiàn）下,硒熒光（guāng）強度響應值最高,結果見表1。

2.2消解液用量

準（zhǔn）確稱取2.0mg(精確至0.0001g)植物標樣柑橘（jú）葉(GBW10020(GSB-11))樣品21份,分3組,每組7次重複。分別（bié）加入混酸比為HNO3+HCl0O4(V+V)=(6+4),(8+2)和(9+1)消解液10.0mL及幾粒玻璃珠冷消解12h過夜,消解處理製樣（yàng）步驟同1.3,測試硒的相對熒光值,結果見表2。

可知:混酸比為HNO3+HClO(V+V)=8+2處（chù）理的柑橘葉樣品中硒的相對熒光值最高,且試樣重複良好,其餘兩組熒光值偏低,重複不穩定,特別是混酸（suān）比為HNO3+HCIO4(V+V)=6+4一組重複（fù）差異較大。說明用（yòng）HNO3+HCO4(V+V)=8+2混（hún）酸比消（xiāo）解處理柑橘葉樣品時,硒的提（tí）取最完全。

全植物（wù）樣品中含有大量有機質（zhì）,在酸（suān）量（liàng）較少的情況下HClO1遇到大量的有機物不僅易發生爆炸,還會造成空白值偏高。實驗中加入的HClO41分別為4.0,2.0,1.0mL。發（fā）現HClO加入量越多,消化液中HCIO4的（de）殘留量（liàng）就越（yuè）多。如果消化至剩餘體積的2mL左右時,HCO冒煙時間過長,硒有損失,則測定（dìng）結果偏差較大;HClO44加入量少,消解速度慢,時間過（guò）短,消解液顏色深,有（yǒu）機質消解又不完全。對於稱樣量為2.0g的柑橘葉樣品來說,選擇混酸比HNO3HClO(V+V)=(8+2)mL,,HClO1加入量為2.0mL,就可（kě）以使有機質（zhì）充（chōng）分消解。當稱樣量大時,可以（yǐ）相應增加（jiā）HClO的量,最終（zhōng）消（xiāo）解液中HClO)殘留量約為0.5~1.0mL較為合適。其他實驗條件的影響研究（jiū）均采用(8十（shí）2)混酸（suān）比來消解植物樣品。

2.3消解溫度（dù）和消解時間的選（xuǎn）擇

準確稱取2.0g(精確至0.0001g)植物標樣茶葉（yè）(GBW10016)樣品和灌木葉(GSB07602)樣品各15份,分3組,每組5次重複稱樣,以2.2中HNO3+HClO4(V+V)(8+2)mL混酸比（bǐ）溶液進行消化處理,再以不同的消解溫度進行消化處理,測試（shì）硒的相對熒（yíng）光值,結果見表3。

準確稱取2.0g(精確至0.0001g)植物標（biāo）樣茶葉(GBW10016)樣品和灌木葉(GSB07602)樣品各24份,分8組,每組3次重（chóng）複稱樣,以2.2中HNO3+HClO4(V+V)(8+2)mL混酸（suān）比溶液,以表3中的160~180C為消化溫度,分別設定8組消化時間為（wéi）2,3,4,5,6,7,8,9h,測試硒的相對熒光值,結果見圖1。

由表3和圖1可知:消化溫度控製在160~180C之間消化時間在6~7h之間（jiān）時（shí）,兩種植物樣品硒（xī）的提取最完全;當消化溫度<160C,或>180C時,消化時間過短或（huò）過長時（shí）,硒消化不徹（chè）底或容易揮發,都會導致熒光（guāng）值偏（piān）低且不穩定。

2.4還原劑硼（péng）氫化鉀(KBH4)和載（zǎi）流鹽酸(HCI)的影響

在儀器（qì）條件不變的情（qíng）況下,測（cè）試10Hg•L-的Se標準溶液隨載流HCl和還原劑KBH4濃度變化對硒熒光強度的影響,結果（guǒ）見圖2和圖3。可知,當載流HCl和還原劑KBH4濃度低時熒光強度低（dī）,信號靈敏度差,說明還（hái）原能力弱;當載流HCl和還原劑KBH41濃度增大時,熒光強度也隨之增強;當兩者濃度太高時,反應產生的氫（qīng）氣多,泡沫都易衝入管道,熒光強度反而會降低,這是由於（yú）過量的氫氣稀釋了火焰（yàn）中硒原子蒸氣造成的。實驗結果表明:對於10pg•L1的Se標準（zhǔn）溶液,還原劑KBH4濃度在0.8%~2.0%(m/V)之間,載（zǎi）流HC1濃度在4%~15%(g)之間,火焰平穩,熒光值達到最大且穩定,信噪比和靈（líng）敏度最高。綜合（hé）考慮選擇還原劑濃度為1.0%KBH4(m/V)+0.5%KOH(m/V),載流HC1為10%(g)。

所配還原劑KBH4溶液要含有一定濃度的KOH以保證溶液（yè）的穩定性。建議KOH的濃度為0.2%~0.5%(m/V),濃度過低,KBH4會分解,濃度過高則（zé）會影響氧化還原反應的（de）總體酸度,離開KOH和KBH4的濃度來討論最佳酸度（dù）是毫無意（yì）義的。

2.5樣品（pǐn）酸度(HC的選擇樣

品消（xiāo）化過程的酸度確保了Se+還原成Se+,上機測試前（qián）樣品（pǐn）經稀釋後製備液酸度也（yě）會影響硒（xī）的測定結果。分別（bié）吸取100gg•L-標準應用液5.0mL於7個50mL的具塞比色（sè）管中,分別加入0.0,1.5,2.5,5.0,10.0,15.0,20.025,0mL濃HCl,用（yòng）純水稀釋定容至刻度（dù）,用以製備不同酸度的10gg•L硒標（biāo）準溶液,以2.4中的最佳載流和還原劑濃度進行上機測定,結果（guǒ）見圖（tú）4。可知,扣除空白後,HCl(g)在3%~20%範（fàn）圍內,10gg•L-1硒標（biāo）準溶液具有（yǒu）較強且穩定的熒（yíng）光強度（dù）;當樣品HCl(q)>20%時,硒熒光值受到抑製且不穩定,考慮到樣品（pǐn）酸（suān）度（dù）的提高有利於硒的還原,同時可以減少共（gòng）存元素的幹擾,故（gù）本方法選用15%HCl(g)酸度作為樣品和標準溶液上機測試時製備液的酸度,才能（néng）保證測量的穩定性和一致性。

2.6線性方程、檢（jiǎn）出限

植物樣品硒的（de）測定中,標準曲線範圍無需很大,本實驗在（zài）0~10!g•L-的濃（nóng）度範圍內標準曲線線性相關很好,r=0.9999,回歸方程y=131.67x+203.94;又對（duì）0~100gL-濃度範圍進（jìn）行了測定,其線（xiàn）性相關也很好,r=0.9997,回歸方程為y=132.43x+315.13,說明本方法（fǎ）不僅靈（líng）敏度高,而且線性範圍寬。

在本實驗條件下,連續測定空白熒光（guāng）值11次,並以（yǐ）3倍的標準偏差除以工作曲線的斜率計算出溶液中硒的檢岀限0.018g•L-1,若以2.0g植（zhí）物樣品最後定（dìng）容25mL計算,樣品檢出限（xiàn）0.225gg•kg-1

2.7標準物質分析及回收率和精密度

分別選取灌木葉（yè）、大米、圓白菜、茶（chá）葉和柑橘葉五種植物標準樣品,每種重複3次準確稱取2.0g(精確至0.0001g),按上（shàng）述實驗條件進行消解,測定本（běn）底值。再對每種植物標樣稱取子（zǐ）樣,每（měi）種重（chóng）複3次準確稱取2.0g(精確至0.0001g),此次每（měi）種試樣中分別加入1.0mg•L-1硒標準溶液150,300,450gL,進行消解（jiě）並測定加標後值,同時測定硒（xī）質控環境標準溶（róng）液(GSBZ50031-94(203710)),結果見表4。可見,硒標準加標回收（shōu）率在87.1%~106.2%之間,精密度(n=3)在0.83%~5.69%之間,所測結果均與標準物質的（de）參考值吻合,完全達到分析要求。

3、結論

采用程序（xù）控溫石（shí）墨爐消解-氫化物熒光光諧法在（zài）本（běn）文得到的最佳實驗條件下測定以柑橘葉、茶葉、灌木葉（yè）、圓白（bái）菜、大米等為代表的幾種植物樣品中的硒,線性（xìng）範圍寬、靈敏度高、檢出限低、穩定性好的顯著特點,尤其適合（hé）這類批量（liàng）植物（wù）樣品中硒的痕量分析,且（qiě）該方法操（cāo）作簡便安全,實用性強,儀器成本低,所用試劑毒性（xìng）小,可作為一般（bān）實驗室的常規分析方法（fǎ）。

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